Spring til indhold

Calciumvisualisering

Fra Wikipedia, den frie encyklopædi
(Omdirigeret fra Calcium imaging)
En typisk opsætning til visualisering af calcium i isolerede hjertemuskelceller

Calciumvisualisering eller Calcium imaging er en mikroskopiteknik til optisk måling af hvor og hvor meget calcium (Ca2+) der er i en celle, et væv eller et medium. Calciumvisualisering udnytter såkaldte calciumindikatorer, der er fluorescerende molekyler, der reagerer på bindingen af Ca2+-ioner ved at ændre deres fluorescensegenskaber. Der findes to hovedklasser af calciumindikatorer: kemiske indikatorer og genetisk kodede calciumindikatorer.[1] Calciumvisualisering har muliggjort undersøgelser af calciumsignalering i en lang række celletyper. I neuroner er elektrisk aktivitet altid ledsaget af en strøm af Ca2+ ioner ind i cellen. Calciumvisualisering kan således bruges til at overvåge den elektriske aktivitet i hundredvis af neuroner i cellekultur eller i levende dyr, hvilket har gjort det muligt at dissekere funktionen af neurale netværk. Calciumvisualisering anvendes også til at måle planters sansning af omverdenen og den interne kommunikation mellem plantedele.

Kemiske indikatorer

[redigér | rediger kildetekst]
Humane HEK293 celler med den fluorescerende calciumindikator Fluo-4, der fluorescerer alt efter hvor meget calcium den binder. Fluorescensen er visualiseret med et fluorescensmikroskop.
Nerveceller der har været inkuberet med den flurescerende calcium-indikator Fura-2 AM og derefter er blevet stimuleret med kaliumklorid.

Kemiske indikatorer er små fluorescerende molekyler, der kan binde (kelatere) calciumioner og som følge heraf ændrer deres fluorescens. Alle disse molekyler er baseret på molekylet BAPTA, der er en variant af EGTA, og som EGTA er udstyret med fire carboxylgrupper, der gør det muligt for molekylet at binde to Ca2+ ioner med høj affinitet.

Kemiske indikatorer omfatter fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4 og Calcium Green-1.

Disse farvestoffer tilsættes ofte i en form, hvor carboxylgrupperne er maskeret som acetoxymetylestere. Dette gør molekylet lipofilt og tillader, at det let kan passere cellemembranen og dermed få adgang til cellen. Når først molekylet er inde i cellen, vil cellulære esteraser frigøre carboxylgrupperne, og molekylet vil være i stand til at binde calcium. Alternativt kan det umaskerede molekyle med frie carboxylsyrer sprøjtes direkte ind i celler ved hjælp af en mikroelektrode eller mikropipette, som fjerner usikkerheder med hensyn til det cellulære rum, der indeholder farvestoffet (acetoxymethylesteren).

Binding af en Ca2+-ion til et fluorescerende kemisk indikatormolekyle fører til enten en stigning i kvanteudbyttet af fluorescensen eller en forskydning af bølgelængerne af lys i den indgående eller udgående stråling. Individuelle kemiske Ca2+ fluorescerende indikatorer anvendes til målinger af calcium i en lang række cellulære præparater. Den første Ca2+-visualisering i form af en videooptagelse i normal tid blev udført i 1986 i hjerteceller ved hjælp af sensitive videokameraer.[2] En senere udvikling af teknikken muliggjorde meget detaljeret visualisering af calcium i en celle ved hjælp af konfokal laserscanningmikroskopi.[3]

Genetisk kodede calciumindikatorer

[redigér | rediger kildetekst]

Genetisk kodede calciumindikatorer er proteiner, der kan anvendes til in vivo visualisering af calcium cellulære, udviklingsmæssige og fysiologiske processer.[4][5][6][7] Genetisk kodede calciumindikatorer behøver ikke at blive tilsat til eller blive injiceret i enkelte celler hver for sig; i stedet kan generne, der koder for disse proteiner, indføres i individuelle celler, cellelinjer eller hele organismer ved forskellige transfektions og eller transgene metoder. Det er således muligt at skabe transgene dyr og planter, der udtrykker indikatoren i alle celler eller selektivt i visse cellulære undertyper. I medicinsk forskning kan genetisk kodede calciumindikatorer fx bruges til at studere calciumbevægelser i neuroner,[8][9] T-celler,[10] hjertets muskelceller[11] og andre celletyper. Nogle genetisk kodede calciumindikatorer rapporterer forekomsten af calcium ved direkte emission af fotoner (luminescens), men de fleste er afhængige af fluorescerende proteiner som reportere, herunder grønt fluorescerende protein (GFP) og dets varianter: forbedret GFP (eGFP), gult fluorescerende protein (YFP), rødt fluorescerende protein (RFP) og cyanfarvet fluorescerende protein (CFP).

En gruppe af genetisk kodede calciumindikatorer baserer sig på et enkelt fluorescerende protein. I denne gruppe befinder sig såkaldte ratiometriske systemer, der kendetegnes ved at der sker en ændring i absorbans/emissionsspektrene som følge af Ca2+-binding. [12] Et senere udviklet enkelt-fluorescerende protein-system, kaldet GCaMP, baserer sig på et cirkulært permuteret GFP. En af proteinet terminale ender er fusioneret med calmodulin, og den anden terminale ende er fusioneret med M13 (et peptid fra det calmodulin-bindende domæne i proteinet myosin letkæde kinase).[13] Proteinet er designet således, at de terminale ender befinder sig tæt på hinanden. Når Ca2+ binder til calmodulin, øges calmodulins affinitet for M13 peptidet, og når det binder sig til det forårsager det en konformationel ændring i det permuterede GFPs struktur, der påvirker den indbyggede kromofor, således at fluorescensen forstærkes. GCaMP og dets raffinerede varianter kan binde Ca2+ med meget høj affinitet (i det nanomolære koncentrationsområde). [14] Et andet enkelt-fluorescerende protein er CatchER, som har en noget lavere affinitet for Ca2+.[15]

En anden gruppe af genetisk kodede calciumindikatorer baserer sig på to fluorescerende proteiner, der er koblet sammen. Parrede fluorescerende proteinsystemer omfatter de såkaldte cameleoner ("cam" er en forkortelse af calmodulin). Cameleoner består typisk af en række fusionerede proteiner, der udover to forskellige fluorescerende proteiner, kan være calmodulin, det calmodulinbindende peptid M13 fra myosin letkæde kinase og en glycylglycin-linker.[12] I fravær af Ca2+ vil kun et af de to fluorescerende proteiner være fluorescerende. En ændring af proteinets form (konformation) forårsaget af calciumbinding får det andet fluorescerende protein til at rykke nærmere, hvilket tillader Förster resonansenergioverførsel (FRET) at finde sted fra det ene protein til det andet, således at det andet protein nu bliver fluorescerende men med en fluorescens, der har en anden farve end det første proteins. Cameleonindikatorer producerer et ratiometrisk signal (dvs. den målte FRET-effektivitet afhænger af calciumkoncentrationen). Originale varianter af kameleoner var oprindeligt meget følsomme over for ændringer af cellens surhedsgrad, men ved at introducere to mutationer i det modtagende protein, blev der opnået en større pH resistens.[16]

Genetisk kodet Ca2+ indikator År Sensor Rapportør Baseret på
Cameleoner[17] 1997 Calmodulin FRET par: BFP eller CFP, og GFP eller YFP -
FIP-CBSM[18] 1997 Calmodulin FRET par: BFP og RFP -
Pericams[19] 2000 Calmodulin cpGFP -
GCaMP[14][20] 2000 Calmodulin Permuteret eGFP -
TN-L15[21] 2004 Modificeret kylling skeletmuskel troponin C FRET par: YFP og CFP -
TN-humTnC[21] 2004 Humant hjertetroponin C FRET par: YFP og CFP -
TN-XL[22] 2006 Modificeret kylling skeletmuskel troponin C FRET par: permuteret YFP og CFP TN-L15
TN-XXL[23] 2008 Modificeret csTnC i TN-XL[24] FRET par: permuteret YFP og CFP TN-XL
Twitch's[25] 2014 Troponin C FRET par (varianter af to FPer) -
RCaMP1[26] 2013 Calmodulin mRuby (et rødt FP)[27] -
jRGECO1a[28] 2016 Calmodulin mMaple (et rødt FP)[29] R-GECO[30]

En særlig klasse af genetisk kodede calciumindikatorer er designet til at danne et permanent fluorescerende mærke i aktive neuroner. De er baseret på proteinet Eos,[31], som skifter fra grønt til rødt, når det belyses med violet lys. mEos (monomeric Eos) er en hyppigt anvendt variant af Eos. Kombineret med calciumsensoren calmodulin vil neuroner, der har forhøjede calciumniveauer, udsende rødt lys, når de belyses med violet lys. SynTagMA[32] er en version af CaMPARI2,[33] der er målrettet mod synapser.

Genetisk kodet Ca2+ indikator År Sensor Rapportør Baseret på
CaMPARI[34] 2015 Calmodulin + violet lys mEos: grøn til rød farveændring -
CaMPARI2[33] 2018 Calmodulin + violet lys mEos: grøn til rød farveændring CaMPARI
SynTagMA[32] 2020 Calmodulin + violet lys mEos: grøn til rød farveændring CaMPARI2
TubuTag[35] 2021 Calmodulin + violet lys mEos: grøn til rød farveændring CaMPARI2

Brug

[redigér | rediger kildetekst]

Uanset hvilken type indikator der anvendes, er billedbehandlingsproceduren generelt meget ens. Signalet i celler, der har optaget en indikator, eller udtrykker den som et protein i tilfældet med genetisk kodede calciumindikatorer, kan visualiseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop og detekteres ved hjælp af en sCMOS billedsensor (s'et står for scientific)[36] eller et CCD-kamera. Konfokal- og to-foton mikroskoper giver optisk sektionsevne, så calciumsignaler kan i tynde optiske snit, endda i tykke prøver såsom pattedyrshjerner. Billeder analyseres ved at måle ændringer i fluorescensintensitet for en enkelt bølgelængde eller to bølgelængder udtrykt som et forhold mellem de to intensiteter (ratiometriske indikatorer).

Referencer

[redigér | rediger kildetekst]
  1. ^ de Melo Reis, Ricardo Augusto; Freitas, Hércules Rezende; de Mello, Fernando Garcia (2020). "Cell Calcium Imaging as a Reliable Method to Study Neuron–Glial Circuits". Frontiers in Neuroscience. 14: 975. doi:10.3389/fnins.2020.569361. ISSN 1662-453X. PMC 7566175. PMID 33122991.
  2. ^ Cannell MB, Berlin JR, Lederer WJ (1987-01-01). "Intracellular calcium in cardiac myocytes: calcium transients measured using fluorescence imaging". Society of General Physiologists Series. 42: 201-214. PMID 3505361.
  3. ^ Stricker SA, Whitaker M (1999) Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in living cells Arkiveret 4. maj 2023 hos Wayback Machine. Microscopy Research and Technique 46: 356-69.]
  4. ^ Hendel T, Mank M, Schnell B, Griesbeck O, Borst A, Reiff DF (juli 2008). "Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro". The Journal of Neuroscience. 28 (29): 7399-7411. doi:10.1523/JNEUROSCI.1038-08.2008. PMC 6670390. PMID 18632944.
  5. ^ Gordon S, Dickinson MH (marts 2006). "Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11): 4311-4315. Bibcode:2006PNAS..103.4311G. doi:10.1073/pnas.0510109103. PMC 1449689. PMID 16537527.
  6. ^ Kerr R, Lev-Ram V, Baird G, Vincent P, Tsien RY, Schafer WR (juni 2000). "Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans". Neuron. 26 (3): 583-59. doi:10.1016/S0896-6273(00)81196-4. PMID 10896155. S2CID 311998.
  7. ^ Kim J, Lee S, Jung K, Oh WC, Kim N, Son S, et al. (januar 2019). "Intensiometric biosensors visualize the activity of multiple small GTPases in vivo". Nature Communications. 10 (1): 211. Bibcode:2019NatCo..10..211K. doi:10.1038/s41467-018-08217-3. PMC 6331645. PMID 30643148.
  8. ^ Afshar Saber W, Gasparoli FM, Dirks MG, Gunn-Moore FJ, Antkowiak M (2018). "All-Optical Assay to Study Biological Neural Networks". Frontiers in Neuroscience. 12: 451. doi:10.3389/fnins.2018.00451. PMC 6041400. PMID 30026684.
  9. ^ Kovalchuk Y, Homma R, Liang Y, Maslyukov A, Hermes M, Thestrup T, et al. (februar 2015). "In vivo odourant response properties of migrating adult-born neurons in the mouse olfactory bulb". Nature Communications. 6: 6349. Bibcode:2015NatCo...6.6349K. doi:10.1038/ncomms7349. PMID 25695931.
  10. ^ Mues M, Bartholomäus I, Thestrup T, Griesbeck O, Wekerle H, Kawakami N, Krishnamoorthy G (juni 2013). "Real-time in vivo analysis of T cell activation in the central nervous system using a genetically encoded calcium indicator". Nature Medicine. 19 (6): 778-783. doi:10.1038/nm.3180. PMID 23685843. S2CID 205391240.
  11. ^ Shinnawi R, Huber I, Maizels L, Shaheen N, Gepstein A, Arbel G, et al. (oktober 2015). "Monitoring Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes with Genetically Encoded Calcium and Voltage Fluorescent Reporters". Stem Cell Reports. 5 (4): 582-596. doi:10.1016/j.stemcr.2015.08.009. PMC 4624957. PMID 26372632.
  12. ^ a b Park JG, Palmer AE (2014). "Quantitative measurement of Ca2+ and Zn2+ in mammalian cells using genetically encoded fluorescent biosensors". Fluorescent Protein-Based Biosensors. Methods in Molecular Biology. Vol. 1071. s. 29-47. doi:10.1007/978-1-62703-622-1_3. ISBN 978-1-62703-621-4. PMC 4051312. PMID 24052378.
  13. ^ Rodriguez EA, Campbell RE, Lin JY, Lin MZ, Miyawaki A, Palmer AE, et al. (februar 2017). "The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins". Trends in Biochemical Sciences. 42 (2): 111-129. doi:10.1016/j.tibs.2016.09.010. PMC 5272834. PMID 27814948.
  14. ^ a b Nakai J, Ohkura M, Imoto K (februar 2001). "A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein". Nature Biotechnology. 19 (2): 137-141. doi:10.1038/84397. PMID 11175727. S2CID 30254550.
  15. ^ Pérez Koldenkova V, Nagai T (juli 2013). "Genetically encoded Ca(2+) indicators: properties and evaluation". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833 (7): 1787-1797. doi:10.1016/j.bbamcr.2013.01.011. PMID 23352808.
  16. ^ Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (marts 1999). "Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5): 2135-2140. Bibcode:1999PNAS...96.2135M. doi:10.1073/pnas.96.5.2135. PMC 26749. PMID 10051607.
  17. ^ Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA, Ikura M, Tsien RY (august 1997). "Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin". Nature. 388 (6645): 882-887. Bibcode:1997Natur.388..882M. doi:10.1038/42264. PMID 9278050.
  18. ^ Romoser VA, Hinkle PM, Persechini A (maj 1997). "Detection in living cells of Ca2+-dependent changes in the fluorescence emission of an indicator composed of two green fluorescent protein variants linked by a calmodulin-binding sequence. A new class of fluorescent indicators". The Journal of Biological Chemistry. 272 (20): 13270-13274. doi:10.1074/jbc.272.20.13270. PMID 9148946.
  19. ^ Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (marts 2001). "Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6): 3197-3202. Bibcode:2001PNAS...98.3197N. doi:10.1073/pnas.051636098. PMC 30630. PMID 11248055.
  20. ^ Dana H, Sun Y, Mohar B, Hulse BK, Kerlin AM, Hasseman JP, et al. (juli 2019). "High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments". Nature Methods. 16 (7): 649-657. doi:10.1038/s41592-019-0435-6. PMID 31209382. S2CID 189927684.
  21. ^ a b Heim N, Griesbeck O (april 2004). "Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin C and green fluorescent protein". The Journal of Biological Chemistry. 279 (14): 14280-14286. doi:10.1074/jbc.M312751200. PMID 14742421.
  22. ^ Mank M, Reiff DF, Heim N, Friedrich MW, Borst A, Griesbeck O (marts 2006). "A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change". Biophysical Journal. 90 (5): 1790-1796. Bibcode:2006BpJ....90.1790M. doi:10.1529/biophysj.105.073536. PMC 1367327. PMID 16339891.
  23. ^ Mank M, Santos AF, Direnberger S, Mrsic-Flogel TD, Hofer SB, Stein V, et al. (september 2008). "A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging". Nature Methods. 5 (9): 805-811. doi:10.1038/nmeth.1243. PMID 19160515. S2CID 5501437.
  24. ^ Mank M, Reiff DF, Heim N, Friedrich MW, Borst A, Griesbeck O (2006) A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal 90: 1790-6.
  25. ^ Thestrup T, Litzlbauer J, Bartholomäus I, Mues M, Russo L, Dana H, et al. (februar 2014). "Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes". Nature Methods. 11 (2): 175-182. doi:10.1038/nmeth.2773. hdl:11858/00-001M-0000-0017-C32A-B. PMID 24390440. S2CID 11620748.
  26. ^ Akerboom J, Carreras Calderón N, Tian L, Wabnig S, Prigge M, Tolö J, et al. (2013). "Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics". Frontiers in Molecular Neuroscience. 6: 2. doi:10.3389/fnmol.2013.00002. PMC 3586699. PMID 23459413.
  27. ^ Kredel S, Oswald F, Nienhaus K, Deuschle K, Röcker C, Wolff M, Heilker R, Nienhaus GU, Wiedenmann J (2009) mRuby, a bright monomeric red fluorescent protein for labeling of subcellular structures. PLoS One 4: e4391
  28. ^ Dana H, Mohar B, Sun Y, Narayan S, Gordus A, Hasseman JP, et al. (marts 2016). "Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity". eLife. 5: e12727. doi:10.7554/eLife.12727. PMC 4846379. PMID 27011354.
  29. ^ Griffiths N, Jaipargas EA, Wozny MR, Barton KA, Mathur N, Delfosse K, Mathur J (2016) Photo-convertible fluorescent proteins as tools for fresh insights on subcellular interactions in plants. Journal of Microscopy 263: 148-57.
  30. ^ Zhao Y, Araki S, Wu J, Teramoto T, Chang YF, Nakano M, et al. (september 2011). "An expanded palette of genetically encoded Ca²⁺ indicators". Science. 333 (6051): 1888-1891. Bibcode:2011Sci...333.1888Z. doi:10.1126/science.1208592. PMC 3560286. PMID 21903779.
  31. ^ Wiedenmann J, Ivanchenko S, Oswald F, Schmitt F, Röcker C, Salih A, Spindler KD, Nienhaus GU (2004) EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101: 15905-15910.
  32. ^ a b Perez-Alvarez A, Fearey BC, O'Toole RJ, Yang W, Arganda-Carreras I, Lamothe-Molina PJ, et al. (maj 2020). "Freeze-frame imaging of synaptic activity using SynTagMA". Nature Communications. 11 (1): 2464. Bibcode:2020NatCo..11.2464P. doi:10.1038/s41467-020-16315-4. PMC 7235013. PMID 32424147.
  33. ^ a b Moeyaert B, Holt G, Madangopal R, Perez-Alvarez A, Fearey BC, Trojanowski NF, et al. (oktober 2018). "Improved methods for marking active neuron populations". Nature Communications. 9 (1): 4440. Bibcode:2018NatCo...9.4440M. doi:10.1038/s41467-018-06935-2. PMC 6202339. PMID 30361563.
  34. ^ Fosque BF, Sun Y, Dana H, Yang CT, Ohyama T, Tadross MR, et al. (februar 2015). "Neural circuits. Labeling of active neural circuits in vivo with designed calcium integrators". Science. 347 (6223): 755-760. doi:10.1126/science.1260922. PMID 25678659. S2CID 206562601.
  35. ^ Perez-Alvarez A, Huhn F, Dürst CD, Franzelin A, Lamothe-Molina PJ, Oertner TG (2021). "Freeze-Frame Imaging of Dendritic Calcium Signals With TubuTag". Frontiers in Molecular Neuroscience (engelsk). 14: 635820. doi:10.3389/fnmol.2021.635820. PMC 7982875. PMID 33762909.
  36. ^ Nguyen JP, Shipley FB, Linder AN, Plummer GS, Liu M, Setru SU, et al. (februar 2016). "Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8): E1074-E1081. arXiv:1501.03463. Bibcode:2016PNAS..113E1074N. doi:10.1073/pnas.1507110112. PMC 4776509. PMID 26712014.
Hentet fra "https://da.wikipedia.org/w/index.php?title=Calciumvisualisering&oldid=11795512"